关于单克隆筛选和单克隆源性的验证，有最近华药老师的文章在上（点击文末“阅读原文“），也有前FDA Audrey Jia老师访谈视频在后（本期下篇），小编不敢再班门弄斧，二话不说，用图说话。
关于全孔清晰成像
全孔清晰成像，尤其是边缘细胞能不能清晰成像，正确的例子是这个样子的：图片分辨率高，孔壁边缘清晰。
图1：Clonal image sample.
图2：Non clonal image sample.
对于孔的边缘效应，实际上还有不少老师专门要去对孔中的液体工作体积和不同品牌的板子做验证，如果图像都不清晰，这些工作根本无从谈起。让我们看看放大后孔的边缘是这个样子的：
图3，图4：验证孔中不同工作体积和不同品牌板型对边缘效应的影响。
1.孔中液体体积对孔边缘的照明有影响。当位于孔边缘时，细胞有时会出现“阴影”，这种效应阻碍了单细胞在孔边缘的识别。对孔里不同工作体积进行评估,发现150µL时阴影最少。
2.接着用此体积比较Nunc和康宁96孔板：Nunc板孔边缘细胞的图像与康宁相比阴影很少；此外，Nunc板也显示出更清晰的孔壁。因此在本项工作中Nunc 96孔板的边缘效应小于康宁96孔微孔板。
Rachel Richer, et al.,Mammalian Cell Culture R&D, FUJIFILM Diosynth Biotechnologies, UK
所以做为单克隆源性证据的照片不可以是这个样子的：
图5：很难作为单克隆源性证据的D0图像举例局部。
为什么不可以呢？小编还是要啰嗦一下，因为1.如果孔壁边缘不清晰，靠壁的细胞会被“隐藏”，也许孔壁边缘真实的情况是这个样子的：
图6：D0全孔照片局部。竟然有一个细胞！
细胞往往“喜欢”靠近基质边缘生长，或采用离心沉底时，细胞也常常会“靠壁”，因此如果孔边缘不清晰，会导致看不到细胞，或分辨不出“细胞的影子”，造成假阳性或假阴性的结果。而更可怕的是，图片不清晰时，欣赏雪后白茫茫的景色的您，可能根本都不知道有这个风险。
也因为2.图片不清晰会导致无法分辨出相临贴近生长的细胞，上面“坏”例子图中那个“孤零零”的细胞，放大看也许是这个样子的：
图7：D0全孔照片局部，细胞处单独放大。原来是两个细胞！图片不清晰会导致无法分辨出相临贴在一起生长的细胞。
关于逐孔聚焦成像
手摸着多孔板，觉得底部是平的，而实际上任何品牌的多孔板各孔的聚焦平面都是不一样的，检测前用激光辅助聚焦逐孔扫描后真实的板底是这个样子的：
图8：多孔板真实的每孔聚焦平面。
可放大看一下标尺，同一块板中有200–300微米的整体差异，细胞有多大？如果只按某一个孔的聚焦数值去对所有孔成像，那么漏检细胞是大概率的事件，这样的图像也很难做为单克隆源性证据。
淘气的小明去上学了吗：WHY VIPS?
“小明去上学了吗？” “恩，他出门了。”
而很多单细胞打印机提供的单克隆源性“证据”就是这个样子的：
图9：小明出门了。
铺板后，如果板中仍有不少没有细胞和多于一个细胞的孔，那么入孔前喷嘴中的照片做为单克隆源性的“证据“，不要说监管部门，我们自己都很难接受。
杨森公司的Thomas Kelly老师也说过：
“许多单细胞打印或移液系统可显示细胞在到达多孔板前的图像，而不是在多孔板中的图像 ”。
“ 我们认为VIPS对多孔板本身的成像是非常重要和可靠的。”
“如果你只是在细胞去多孔板的路上拍了张照片，那实际到板子中的细胞可能比你想象的要多”。
（链接：应用VIPS,杨森将细胞系开发所需的时间缩短了一半）
GENMAB公司的Jolanda Gerritsen老师也说过：
“有很多其他的细胞打印机在细胞去微孔的途中拍照，但这不敢说细胞是否真的到达了孔里。”
（链接：Genemab采用一个简单的方法，极大的缩短了细胞株开发的时间）
搞得小编没啥话说了。VIPS的纳升级小液滴滴入干孔后，成像是这个样子的：
图10：VIPS结果与Cell Metrics结果的比较，单个细胞。Thomas Kelly，Janssen.
显示VIPS液滴中检测到的单个细胞（上半图），然后在Cell Metrics整孔成像中得到确认（下半图）。
图11：VIPS结果与Cell Metrics结果的比较，两个细胞。Thomas Kelly，Janssen.
显示VIPS液滴中检测到的两个细胞（上半图），然后在Cell Metrics整孔成像中得到确认（下半图）。
杨森公司实际使用中发现，VIPS的液滴细胞图像中，幽灵孔/假阴性的发生率极低（万分之六），并且还能为单克隆源性证据增加可信度，让CM的克隆源性报告得到了扩展：整个孔中细胞群落生长的图像可以一直追溯到最初铺板时孔底一个液滴中的单个细胞图像。
VIPS all–in–one，1加1大于2哦！：
由于VIPS可分配纳升级的液滴，“滴入孔中央的培养物很少，不需要担心孔的边缘对图像的影响，可以很容易地定位细胞，并向监管部门提供更可靠的细胞系克隆源性证明”。
他们打算用VIPS 图像作为其克隆报告的一部分，包括液滴图像和整孔的图像，来证明他们细胞系的克隆源性。Kelly解释说:“我们设想将来只需向FDA提交整个孔中液滴的VIPS图像。”
最后，以小编公众号的头像结束本期文献解读，二话不说，用图说话：
图12 ：VIPS单细胞铺板结果。例中铺板效率为87%。绿色孔=单细胞；红色孔= >1细胞；灰色孔= 0细胞。（链接：VIPS应用报告：从不到200个克隆中筛选出商用生产细胞株）