新的变革－是时候在细胞株开发中舍弃荧光筛选法了！
Dr. Ian Taylor , 2019–5–21
我刚从哥本哈根的ESACT回来，会上来自世界各地的顶级科学家们展示很多非常高质量的海报，又一次给我留下了深刻的印象。
促使我写下这篇Blog的原因，是惊讶于会上使用荧光进行研究的海报数量之多，这些荧光法有的用于检测克隆的分离，也有用于细胞株开发过程中筛选分泌潜在蛋白的克隆。
不可否认，许多细胞株开发研究人员总有一种感觉，就是在转染之后，有必要筛选数千个克隆去找到那一小部分的高产株。其依据是，通过荧光检测(标记抗体或肽)，在单个细胞阶段就很早地去检测和分离出生产最多抗体(或其它蛋白)的细胞。这个方法的理论基础在于，通过外源基因随机插入得到的典型克隆分布中，高产群体只占整个细胞群体的很小部分，如绿色框所示（图1）。
图1：随机整合得到的克隆分布。
类似于“淘金”，用荧光法筛选“金块”高产株的概念并不新鲜。如果把时间退回到2005年，我和Genetix的同事们正是基于这个概念研发出了ClonePix FL。ClonePix FL用于将细胞从半固体培养基中分离：当细胞生长并分泌抗体到培养基中时，用荧光标记的二抗检测，随后把高产克隆“挑出来”。
但是这种方法和目前其他的这些荧光法，其实都同样存在着一个很大的缺陷：单个细胞阶段的荧光与摇床扩增后克隆的最终产量，实际上缺乏相关性。
事实上，荧光筛选只是简单地去除了不生产抗体的克隆群体(那些屏幕上没有荧光的克隆)，而不是鉴别出了高产株。这使得日后对摇床培养扩增的克隆进行抗体产量排序时，一些利用荧光法分离筛选细胞的设备（诸如Cytena f. sight，Cyto–Mine，包括昂贵的Beacon等），其荧光筛选结果实际上并没有什么参考意义。在我看来，现在至关重要的应该是改变传统思路，是时候应该为细胞株开发新的变革方法 “摇旗呐喊”了。这种新方法就是使用转座酶。通过巧妙的载体设计和靶向基因整合，完全可以得到一个细胞群体，其中大多数克隆的GOI（gene of interest）都插入到了特定的位点，因此大多数都是高表达、可预测和稳定的克隆。比如辉瑞(Pfizer)等一些制药公司都有自己的专利方法，用包含“着陆平台”（landing pads）的载体来实现这一目标。此外，转座酶技术也有很好的商业化产品可以选择。
Solentim最近与其中一家提供转座酶技术(Leap–in™)的ATUM公司合作。这个game changer技术利用转座酶，可以将克隆分布大规模地向高产克隆转移：在下面的图2的例子中，62%的克隆都在生产力的第一个四分位。
图2: Leap–In转座酶(ATUM)介导的稳定整合得到的典型的克隆分布。在这个例子中，62%的克隆在前四分位。
在实践层面上，这完全摈弃了荧光法背后的理论基础，这样转染得到的大多数克隆全都是高产量的。因此，成功的细胞株开发，以后只需能高效、可靠地分离单个细胞并建档的系统就够了(例如VIPS)。这种转座酶方法的另一个好处是，克隆也表现出很高的内在稳定性，因此省掉了稳定性研究的一些步骤，节省了更多的时间。Lonza公司最近也在推广其GS piggyBac™转座酶，这也进一步证实了转座酶技术的靠谱。
这篇Blog是想提供给细胞株开发研究者一个重要信息：荧光筛选是一种过时的方法，这个方法只能得到producer 和 non–producer的二元结果。与之相比，转座酶法快速、简单，完成一个项目只需要几块板子就够了，之后克隆可以进行摇床培养和去确定最好的表达株。