蛋白药物是一个数十亿美元的市场，但获得最适的生物治疗生产细胞株一直是工艺中的主要瓶颈。“你能以多快的速度让分子进入一个稳健高效的细胞克隆?对于创新药，进入临床的时间意味着一切” ，纽约州立理工学院纳米生物科学教授Susan Sharfstein解释道。
在过去的几十年里，CHO细胞一直是这些生物药生产的首选表达系统。根据Sharfstein的观点，“这里面有一些历史因素，因为FDA对CHO系统很满意，导致采用这个系统会让监管批准更容易。” 并且这类细胞也很容易处理，能悬浮培养，对病毒感染也有一定的抵抗力。此外，CHO细胞与其他啮齿类动物细胞系相比，还具有与人更相似的糖基化形式。但可能最重要的是:CHO可以在数克每升的效价水平上表达一系列蛋白质，包括酶和抗体。
不幸的是，得到高产细胞株的过程十分低效和繁琐，常常需要在数周内筛选数千个克隆。因为在细胞中引入多个开放阅读框（ORF ,openreading frame)的结构常常会导致破碎的或重排的DNA片段整合到了基因组中，而不是所需要的序列，故而预筛选的步骤不可或缺。
Solentim的首席商务官Ian Taylor表示，目前的一些努力正在简化这些过程，并能显著缩短细胞系开发的时间。2019年，Solentim与ATUM宣布合作快速开发稳产细胞株。ATUM宣称其Leap–In Transposase®表达技术的整合效率“比传统细胞高几个数量级”。Taylor解释说，通过转座酶将GOI（Gene of interest）传递到细胞中，不是随机整合，而是靶向于特定位点。并且，质粒的结构完整性，基因与筛选标记的连锁，以及表达比例平衡都能够得到保持。此外，外源基因插入在染色质的开放区域，这些区域转录活性也更强。“主要的好处是，这让转染后的克隆分布显著偏向于高产细胞株，每个项目需要筛选的克隆数量更少，也不需要荧光标记。现在只需筛选200个或更少的克隆中就可以完成一个项目。”
研究员还可以添加无动物成分的促生长添加剂，如Solentim公司的InstiGRO，来帮助单克隆细胞恢复活力，并生长成细胞群落。（更多相关内容连接请参考文末链接）
提高CHOs的表达能力
Sharfstein的实验室多年来一直在研究CHO细胞的生产力，她说很多因素都可能影响产量，包括培养条件的细节，以及所表达蛋白分子的特性。Sharfstein说:“我们几年前做了一个很好的研究，用UCB Celltech检测了两种单抗的生产能力。两种单抗只有一个氨基酸的差异，但产量却相差超过10倍。”
另一种提高蛋白表达的可能策略是改进目前的筛选系统。
目前代谢筛选几乎取代了抗生素，用细胞生存所需的酶分类，当前主要有抑制谷氨酰胺合成酶(GS)或二氢叶酸还原酶(DHFR)的两类筛选系统。其中GS系统更为常用，在这种情况下，只有携带外源基因（GOI连接有GS基因）的细胞才能存活，一些公司现在可以提供GS完全敲除的细胞株（GS–null CHO K1），消除了抑制GS的有毒化学物质的需要。
这类技术的发展部分得益于本世纪初CHO基因组测序和基因编辑技术的进步。“我认为CRISPR和相关技术未来可以编辑各种细胞株，这将是巨大的进步”。目前，她正在与HocusLocus公司合作研究一种新的细胞系筛选方法，该策略基于在GOI的3 ‘非翻译区表达一种siRNA。mRNA转染细胞作为筛选标记物，然后可以被siRNA降解。她说，这比抗生素或缺陷互补的筛选方法要快得多。（GOI/siRNA高表达筛选系统介绍可参考：http://hocuslocus.com/applications/）
图示：先转染携带目的基因和siRNA的载体，几天后再转染mRNA；mRNA用于表达CD4，也可以被siRNA 靶向降解。高表达目的基因的细胞克隆，也必然会高水平生成siRNA，也就会高效降解CD4的mRNA，降低CD4的表达，这样就无法或难于用磁珠交联的抗CD4抗体扣除；反之，低水平或不表达目的基因的克隆，siRNA水平低，CD4高表达，就易于被磁珠扣除；这是一个多轮富集高表达目的基因克隆的新技术方法。
编辑不仅能带来更有效的筛选方法。据Sharfstein说，她和一些人正致力于细胞株开发和工艺工程，来生产肝素和肝素硫酸盐，这些都是碳水化合物了，甚至都不是蛋白。“工艺过程常常没有模板，你需要进行不少代谢工程的研究来优化生产途径。
CRISPR:一个应该谨慎使用的强大工具
像Sharfstein一样，Charles River实验室的生物学主任Anne–Marie Zuurmond认为很明显CRISPR正在革新细胞株的开发。 “这个系统的美妙之处在于，RNA分子驱动着系统的特异性，而这些分子易于设计和生产。CRISPR领域仍处于起步阶段，但正在迅速发展”，她说，针对mRNA来改变细胞的特性是一种强大的工具，因为宿主基因组并没受到影响。
在CRISPR前沿，最近的焦点是发现新的核酸酶。Zuurmond说:“有不同的性质和针对不同需求的新的Cas9–like蛋白不断涌现，它们扩展了CRISPR工具箱，为基因组编辑和基因调控提供了无限可能。”分离自古菌的Cas14就是这样一个例子，比Cas9小，还可以切割单链DNA（ssDNA）。据报道，另一种Cas9变异体只需要最少的PAM（原间隔序列临近基序），这意味着基因组的更多部分可以作为靶点（该文献介绍见下图）。
图示：CRISPR/Cas系统原本是原核生物为了应付外源遗传物质入侵的一种防卫机制，所谓的CRISPR序列，就是敌人的“黑名单”。每当有一个新的敌人入侵，CRISPR/Cas系统就会剪下它的一段基因作为“身份证”，插入CRISPR序列中保存起来，以备下一次敌袭。
但这段剪下来的“身份证”不是随意选择的，它们的附近往往具有一段特殊的序列，叫做原间隔序列临近基序（PAM）。这段序列根据Cas酶的种类不同而有所不同，现在科学家最常使用、最成熟的spCas9，主要识别的就是NGG序列（N指任意碱基）。spCas9也是目前PAM适用最广泛的Cas酶。但我们简单计算一下，DNA存在四种碱基，NGG出现的可能性只有十六分之一。
博德研究所（Broad Insititude）的David Liu带来了全新的进化版Cas酶——xCas9，比起目前使用最广泛的spCas9，xCas9可以实现更广泛PAM，同时脱靶效应还大大降低。
不过，新技术也有一些必须承认的缺点，包括潜在的脱靶效应。Zuurmond说，CRISPR还需要外源性介质来启动修改基因组的过程。她解释说，Charles River使用CRISPR作为其他策略的正交方法（orthogonal approach）。“对于蛋白过表达细胞株的开发，质粒、慢病毒和CRISPR都得到了应用，涵盖了随机或靶向整合，转染基因的瞬时和稳定过表达的各种方法。”许多公司也采用了类似的方法，主要用更老的一些基因编辑技术，比如rAAV(重组腺相关病毒)，用CRISPR做概念验证（proof of concept），甚至将两种方法混合使用。
Zummond说:“其他基因组编辑技术和干扰方法都有其价值所在，在某些情况下，它们可能会比CRISPR更合适。CRISPR应该被认为是一项非常有价值的技术，可以增强我们的细胞株工程的能力，但它不是唯一的选择。”
单克隆性的确证
Taylor说，对于细胞株开发，无论是为了生物治疗蛋白的生产、基因治疗还是药物的发现，研究人员都必须分离出单个细胞并提供单克隆源性的证据。这一问题近年来受到了FDA的广泛关注，他警告说，如果细胞不是克隆的，其中一个细胞株就可能具有生长优势，超过另一些细胞株。“这会导致产品产量下降，甚至生产出错误的产品—这会是一个代价高昂的错误。”
Solentim提供VIPS(Verified In–situ Plate Seeding)等设备，在日常工作中方便地提供确证单克隆源性的记录。VIPS可以将单个细胞铺入96孔板的干孔中，并进行成像以满足单克隆源性要求。同样由Solentim公司开发的Cell Metric是一种成像仪，用于跟踪克隆生长为细胞群落，Taylor说这是FDA所要求的。
层出不穷的定点基因整合的新方法，新的克隆筛选方式，,CRISPR应用的新领域,以及新的自动化和更稳定的工作流程，让细胞株开发比以往任何时候都更有效率,必将会影响生物医学研究的几乎每一个领域,加快蛋白 (甚至是碳水化合物)的治疗药物的开发。
