“有一个本人经历的故事（2017年的事情），分享一下：当时跟一个海外回来的客户聊DEMO的事情（该客户在国外也是Cell Metric用户），我跟他解释我们的DEMO机特别忙，经常有客户急着做项目，等不及Cell Metric到货，就拿我们的DEMO机去顶着。当时这个客户就非常惊讶地问我：“为什么？他们直接拿你们的DEMO机做项目？难道他们不要做验证么？”
Imager来确认细胞株单克隆性的方法是否需要做验证？该如何做？
1. 方法学验证的必要性：
方法学验证是为了确认该方法学是否可靠。方法学建立前，都应该进行方法学验证，而验证通过后的方法学流程不宜随便修改或变更。
首先，我要澄清一下：这里所谓的“验证”，不是指验证仪器性能是否正常；而是指整个从细胞准备到最后选定Candidate Cell Line 的整个开发流程的方法学验证，而这验证又是围绕着“成像”来进行的。
细胞株开发目的是找到用于生产的MCB，而大家也都了解：从MCB开始，后续实验标准都必须按照GMP标准来执行。可以说细胞株开发处于整个流程中比较特殊的节点：细胞株开发的数据本身属于研究型数据，不必符合GMP，但又是GMP前的最后一个步骤。
从科学严谨的角度来考虑：任何新建立的方法都应该进行方法学验证。从研发风险来考量：方法学验证后的流程更可控，确立好的SOP更易于执行，风险将更低。当然，进行方法学验证会增加一点点时间和金钱成本，这种成本对于整个开发流程来说，“九牛一毛”。
国内的情况：方法学开发，就像论坛和圈里讨论的“度”的问题，也如同大家刚开始是否有必要在细胞株开发流程中加入成像仪一样。不做方法学验证是不是项目申报就一定不行？不一定；做了方法学开发，项目申报就一定能通过？也不一定。但可以明确的是：经过方法学验证的开发流程无疑更科学、更严谨！
毕竟，无论多好的Imager，它都只是一个工具，用来辅助的。
2. 该如何来做这个验证？
对于验证，做Analytical的朋友可能非常熟悉，但对于Cell Line部门来说，应该多数都不涉及。而基于Imager的方法学开发又不同于检测方法类的方法学验证，有精确性、准确性、重复性、LLOD等指标。但从验证的角度来讲，方向是一样的，需要回答的问题是：该如何做，才能确保我认为的单细胞克隆就真的是单细胞克隆；或者：你怎么知道你看到的单个细胞就真的是单个，而不是两个或者更多？
众多因素会影响到影像和单克隆源性判断，而最终的单克隆性结果（概率）是所有这些因素的总和。理论上讲，这个验证得到的概率最好要>95%。
笔者认为，至少应该包括：
a. 有限稀释时，铺板浓度是否稳定均一。比如细胞在Tank里面会自然沉降，上层浓度低，底部浓度高。
b. 沉底是否充分。采用何种方式、何种条件沉底。因为，只有沉底后细胞才能被准确成像。
c. 细胞影像是否准确。明场下看到的细胞，在其他成像方式（如荧光）下是否一致？
d. 错误率统计。细胞板是否放置正确，板号是否输入正确，结果报告编辑是否出错。
e. 交叉检识。最终的结果是否经过不同的人、不同的时间来进行检识判断。
f. Ghost Cell的比率。多少个孔是Day0细胞不可见，但Day4/5/7看到细胞克隆团。
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您好，想请教一下沉底验证怎么验证呢？我们实验室的操作是采用自然沉降2–4h，从来没有想过还需要做验证另外，对于您说的Ghost cell 的比率，这个现象的产生的原因是不是1）由于沉降不完全；2）细胞处于挂壁呢？谢谢！
嗯嗯。沉降2–4h是比较合理的。但即使这样也需要验证。
ghost cell产生的原因除了您说的两个以外，还一个可能会跟成像仪有关，有些品牌的成像仪采用的是定焦模式，因为板底不会完全平整，也会造成因为对焦位置不对，造成ghost cell，这个比率能达到20%。
沉底验证做起来也比较简单，可以在孔内铺上较多的细胞，比如1000个/孔，分不同的时间去成像，比如20min，40min，1h，2h，3h。通常情况下，1h左右99%以上的细胞都会沉底，这样的情况下，可以考虑略微延长沉底时间。即验证1h可沉底，实际操作可再延长1h。我个人建议，可以考虑先静置短时间，再离心，然后再静置短时间。这个过程可以将沉底的时间缩短到1h左右，而且好处也比较多。。。。
也可以考虑静置时间缩短一点，不用那么长。离心有几个好处：1. 可以大幅降低细胞粘壁导致无法对焦的情况；2. 去除气泡；3. 缩短静置时间，降低这个时间内CHO细胞分裂的概率。某些CHO（比如CHO–S）在3h左右分裂的比率会达到20%，即会有20%的细胞铺进去的时候是单个，但静置完成在Day0成像的时候，变成了2个。这种情况在我们的VIPs铺板仪下已经得得到证实。
能否补充一下，是通过什么样的数据才能证明这个细胞是单克隆，就比如说 你说的第一点，铺板浓度是否稳定均一，当我确定验证稳定均一后，是否就可以表示出经过两轮亚克隆之后得到的就是单克隆细胞？
有限稀释方式的克隆筛选得到的单克隆细胞，是概率。实际上，有限稀释方法得到的单克隆是没办法证明单克隆的，只能推定为单克隆。到底多少概率可以推定为单克隆呢？一直没有官方的说法，但FDA等法规部门的reviewer在外与研发人员沟通和交流时，认可＜0.5 cell/well的两轮克隆筛选（按泊松分布，0.5两轮单克隆理论概率为95%），实际评审时，也是这么执行的。
按泊松分布理论计算，96孔板，0.5浓度有限稀释，会有61%孔无细胞（约59个孔），39%的孔有细胞（约37个孔）；在有细胞的这37个孔中，单个细胞孔占30%，超过1个细胞的占9%；所以单克隆比率为：30%/39%=77%，非单克隆为23%。因此两轮有限稀释（0.5浓度）的理论单克隆概率：1–0.23*0.23=95%。
做有限稀释要注意了，如果哪天你按0.5铺板，结果长出来40来个孔有克隆，那么您的实际铺板浓度肯定高于0.5。如果同时考虑细胞存活的话，厉害的实验室长起来30来个孔有克隆团就很牛了！
有客户反馈回来的IND filling信息很有意思。Reviewer在评审IND的时候，向申报者挑战：按泊松分布理论数值，0.5cell/well, 非单克隆孔数应该小于9个，而申报者的孔板内的非单克隆孔数超过了9个，那么实际铺板浓度应该超过0.5了，如果再考虑细胞存活的概率，铺板浓度应该更高，而非0.5。
如上是一个真实案例，希望目前采用有限稀释的朋友，稍加注意。
那一轮有限稀释结合影像证据时，铺板浓度还要求0.5吗？
FDA Reviewers 仍然建议：在没有更多数据支撑的情况下，最好采用＜0.5的浓度来铺板，辅以Cell Metric可只做一轮。从这方面也可以看出，FDA对细胞株单克隆性方面的重视。普遍来讲，涉及法规方面，单抗企业都偏向于保守一些。
