克隆起源（Clonal Derivation）在细胞株开发中重要性的监管视角
上个月初，来自美国FDA的两位资深专家Joel Welch 和Sarah Arden 发表了一篇文献 ，标题为考量“克隆性”:关于哺乳动物细胞库的克隆起源在生物制药开发中重要性的监管视角。我们从这篇最新文献中挑出了一些关键点予以解读，以期让我们的客户对监管部门的要求理解得更加清晰，让今后的相关工作更令人信服。
第一点需要注意的是术语的转变，从以前的“克隆性证据”（proof of clonality）或最近的“克隆性确证”（assuranceof clonality），到“克隆起源细胞群”（clonally–derived population）来描述原始细胞库。这在目前也确实是更合适而且在科学上更准确的表述。
文献讨论了成像法对克隆起源提供支持性数据的重要性,并且基于Solentim设备的相关优势参数来概述了一些会让成像法存在潜在缺陷的因素：（斜体蓝色字体的文字引用自该文献，下同）
最后，成像系统经常与其他克隆手段相结合，如有限稀释、FACS、ClonePix等，实时提供该技术“成功”实施的可视化评估。因此从开发的角度看，成像技术提供了一种有吸引力的方式来提供支持性数据，来确保生产细胞系的克隆起源，并可以替代一些额外的实验室工作。然而，有一些因素会影响到图像的有效性（和“准确性”），如校准、聚焦、照明、焦深、和/或分辨率等。此外，此类成像系统还可提供其他非光学基础的考量，如细胞在孔底的几率，以及在成像过程中在孔内定位细胞的几率。
如作者所言，Imager系统提供了强力的实验数据来支持细胞株的单克隆起源并同时能节省大量的实验室工作。但是，基于成像设备的性能和实验流程的考量，成像系统受一些光学影响因素影响的同时（如光学校准、分辨率、对焦、焦深等），还受到一些非光学因素影响，如细胞是否沉底，细胞的位置等等。
因此，我们需要回答这样的问题：“你怎么知道你拍到的单个细胞就真的是单个，而不是两个或者更多？”
2.1 首先，要选择对的设备，先应避免光学基础上由于设备本身带来的缺陷：高分辨率（每孔拍摄48张照片），全孔清晰成像尤其是孔壁边缘清晰，逐孔准确自动聚焦。（往期链接：文献解读：工程细胞单克隆筛选及单克隆源性验证）
Cell Metric是市面上第一个采用激光测距检测板底距离并成像的单克隆扫描成像产品（“动态对焦”或“自动识别对焦”），通过这种技术可以最大限度降低其他品牌某孔定焦（“傻瓜相机”）导致目标细胞“out of focus”而丢失的情况。
图示：高分辨率（每孔拍摄48张照片），全孔清晰成像尤其是孔壁边缘清晰。
图示：多孔板真实的每孔聚焦平面，同一块板中有200–300微米的整体差异。
VIPS更是在“动态对焦”的基础上，再接再厉，首次采用“断层扫描”或“Z–stack”对焦的方式，从而更为准确地在液滴中找到并精确对焦细胞。并且，铺入的液滴处于孔底中心位置，无需等待沉底也没有边缘效应，可以进一步增强单克隆性证据链。
图示：VIPS铺板，孔底30纳升小液滴和液滴内单个细胞的照片。
2.2 针对非光学因素影响，做好方法学验证，建立标准实验流程（SOP，Standard Operation Procedure）。这些在未来申报时会带来极大的可信性和帮助（往期链接：丁香集锦：关于方法学验证和单克隆概率）。
方法学验证是为了确认该方法学是否可靠。这里所谓的“验证”，不是指验证仪器性能是否正常；而是指整个从细胞准备到最后选定Candidate Cell Line 的整个开发流程的方法学验证，而这验证又是围绕着“成像”来进行的。
Solentim和拓澳生物除了在硬件上，竭力解决FDA关注的各种可能影响成像的因素以外，还将基于客户的实验方法，提供免费的技术咨询，并也会在不久的将来提供收费的方法学验证服务。
图示：沉底验证实验原理。
本文献苦口婆心地解释了进行克隆步骤的必要性，这不仅仅是为了符合监管部门的要求，在科学上也很有必要，同时也是将患者利益放在首位的企业OE的需要（编者注：OE, operational excellence，卓越管理体系）。
文献图示了CHO细胞群体内的自然漂移(natural drift，见下)。强调了变异在一个非克隆起源细胞库中如何被放大，以及对生产变化（manufacturing change）和药品生命周期的潜在影响，细胞库开发中无意中铺入了两个细胞(图1A) v.s. 铺入单个细胞(图1B)：
图1 非克隆起源细胞库的变异性和对生产改变的潜在影响(橙色箭头表示收获产品时的取值范围，蓝色方块表示取值范围的平均值)。y轴上的时间零点反映单细胞分离。
在培养过程中会发生表型漂移，因此会影响收获时的遗传群体平均值（genetic population mean），导致该细胞群体针对给定的属性有一个平均值(用蓝色方框表示)并处在一个范围之中(用橙色箭头表示)。关键在于,在收获时尽管非克隆起源的细胞库可能和克隆起源的具有同样的关键质量属性CQA平均值，但是克隆起始点的不同会导致一个或多个CQA的更大的变异，潜在的更易于发生漂移、转变, 以及在生产生命周期中难以预见的选择压力；图中的生产变化以蓝色箭头显示。细胞库中的这类变异可能会对产品的性能产生可以观测的影响，如果可以量化的话。
与之前公开发表的观点一致，作者重申对克隆起源的考量不应与所有构成质控策略的其他因素割裂开来。作者强调，监管重点应放在确保产品的质量上，并进而“确保患者继续获得必要的医疗药物(例如，降低药物短缺的风险)。此外，检测主细胞库的“克隆起源细胞群”和相应风险的几率不是孤立地去确定，而应在企业的全面质控策略的背景中予以考量”。对于药品的市场生命周期则更复杂一些，重要的是要确保细胞库的一致性，方便未来可以灵活地改变制造规模，甚至转变为灌流培养来满足变化的市场需求。
重要的是在成像方面，作者标注说，“监管部门应该要求充分的细节来评估与克隆起源相关的过程和程序。数据，例如那些支持在细胞库生成过程中发生了什么的图像，应该可供查验和考量。”
这正是Solentim公司在CellMetric和VIPS产品中采用的焦点技术，使用高分辨率的细胞成像系统为克隆起源提供分析确证，并最终为用户提供一个统一的克隆性报告。
最后在结束语中，作者强调“生产细胞株的克隆起源对重复生产和产品质量属性具有切实的潜在影响。”