文献介绍 | 用LEAP-IN转座酶平台加速CMC开发并降低风险
该文献描述了 Leap-In 介导整合的结构和功能特征，阐释了这些独特的特征如何以更有效、更稳健的方法开发高产稳定细胞系。与传统的随机整合法相比，益拼转座酶TM平台的优势有：
•高效率（5-50 copies/cell）、高保真（表达盒无缺失重排等）、高稳定性地进行外源基因插入；
• 倾向插入宿主基因组转录活跃区域，易于获得高表达克隆；
• 可从少于100个单克隆细胞中筛选到可满足工艺要求的高产细胞株；
•转染细胞池（pool）与随后筛选的TOP克隆在产量和产品质量属性上高度类似；
•通过控制筛选严格度（Selection stringency）可以得到在 N-糖基化组成方面有更多多样性的克隆。
总之，Leap-In 介导的细胞系开发工作流程可实现高生产能力、可预测的产品质量、强大的遗传稳定性，并缩短 CMC 开发时间，显著减少资源消耗。
关键词 细胞系开发，整合，转座酶，稳定细胞池（stable pools)，转座酶，转座子
摘要
开发高产稳定生产细胞系是蛋白药IND申请的关键环节。本文介绍了益拼转座酶（ Leap-In Transposase® ）平台，这是一种基于转座子的新型哺乳动物细胞系（如CHO）开发系统，可产生高滴度稳定的转染细胞池（pool），而且pool的抗体产量和产品质量属性与随后筛选出的克隆高度类似。所得克隆的生产能力非常强地偏向于高产率，遗传和表达稳定性始终很高。益拼技术避免了非同源重组方法的低整合率、多联体形成、有害的转基因重组、低平均表达水平、不可预测的产品质量和不一致的遗传稳定性等缺点，可以降低项目风险，并减少开发的时间和相关的花费。
1 背景介绍
开发健康、稳定、高产的细胞系对于治疗性蛋白质、疫苗和基因治疗的商业生产至关重要，但这一步骤常常是限速步骤。由于下一代生物制剂经常需要以最佳比例表达多个亚基(Klein et al., 2012, Spiess et al., 2015)，因此分离稳定、高产细胞系的劳动密集型工序将更加繁杂。传统的稳定细胞系制备方法是基于病毒或质粒的载体，其局限性是整合率低(Kim et al., 2011)、载体插入片段大小有限、遗传不稳定性，以及由于基因沉默(Moritz et al., 2015)导致的表达减少。这些都阻碍了高效稳定CLD流程的标准化。
稳定的基因组整合机制通常分为两类：基于非同源重组的随机整合，和位点特异性重组酶介导的整合(Carver et al., 2020)。实际上，还有第三类稳定的整合机制，其既具有随机整合的高拷贝数，又能够保持外源基因的完整性并将其整合到开放染色质的相关靶位点。这类方法就是转座子的机制，已成为脊椎动物基因发现和基因传递应用的有效工具。
一些转座子系统目前已经被表征，包括天然青鳉鱼 hAT 基因家族元件Tol2 (Kawakami et al., 2000) 、工程化的Tc1/mariner转座子，命名为睡美人 (SB; Mikkelsen et al., 2003) 和 Frog Prince (Miskey et al., 2003) 以及昆虫衍生的天然元件 PiggyBac (Yusa, 2015)。最近，一种新的转座子/转座酶系统–益拼转座酶（ Leap-In Transposase®） 从青蛙转座子中改造而来（Balasubramanian et al., 2018；Boldog et al., 2019）。在这里，我们描述了 Leap-In 介导整合的结构和功能特征，并阐释了这些独特的特征如何以更有效、更稳健的方法来开发高产稳定的细胞系。
2 材料和方法
2.1DNA重组方法
合成重组基因，并在 ATUM 的实验室使用专有技术组装表达元件。使用 Sanger 测序确认组装元件的序列正确。密码子优化的人 IgG1 重链和轻链的表达分别由人和鼠 EF1α 启动子驱动。密码子优化的可变表达水平通过调节5′和3′的调节元件和利用编码序列衰减，来实现谷氨酰胺合成酶基因表达水平的变化。转录单元的两侧是 HS4 和 D4Z4 绝缘子元件。在载体构建体中，细菌选择标记和复制起点的片段通过左右 Leap-In1 边界元件与哺乳动物表达单元分开。GS 实验中的选择条件仅通过谷氨酰胺剥夺进行(Fan et al., 2012) ，没有使用甲硫氨酸亚砜亚胺 (MSX)。
除了选择盒外，为 DG44 实验设计的结构基本相同。鼠二氢叶酸还原酶 (DHFR) 基因通过不同强度的各种 IRES 序列与嘌呤霉素 N-乙酰转移酶基因相连。在补充有不同量甲氨蝶呤 (MTX) 的 HT 培养基中对转染的 DG44 细胞进行筛选。
Leap-In mRNA 使用 TriLink 的 AOF 工艺制造。mRNA 批次按照ATUM 的规范发布。
2.2细胞培养
研究中使用了 HD-BIOP3（Horizon Discovery）和 DG44（Lawrence Chasin 教授）细胞衍生的稳定细胞池和克隆。所有细胞的培养程序在化学成分确定的培养基中进行。每周常规传代细胞 2 至 3 次。通过 ViCell (Beckman) 对细胞进行计数。使用配备 100 µl 吸头的 Neon 电穿孔系统 (Thermo/Invitrogen) 转染细胞，共转染表达构建体（转座子）DNA 和 Leap-In 转座酶mRNA。使用无谷氨酰胺的条件为 BIOP3 细胞系选择了稳定的细胞池，并使用补充有不同 MTX 浓度的 HT 培养基对DG44 进行稳定细胞池的筛选。单细胞克隆由 VIPS 系统(Solentim) 进行。VIPS 和 Cell Metric (Solentim) 仪器证实了单克隆性。按照 ATUM 的标准进料方案，在 24 孔深孔板、离心管或摇瓶中，进行分批补料生产评估容积生产率。
2.3蛋白质纯化
用于产品质量表征的模型抗体培养产品使用蛋白A 捕获纯化。通过 A280 吸光度和使用分子消光系数确定纯化蛋白质的浓度。
2.4蛋白质分析
使用蛋白 A 传感器通过 Octet HTX (Pall) 估计蛋白产率。按照使用说明，用 Caliper 芯片 (PerkinElmer) 分离蛋白质电荷变体。通过疏水相互作用色谱和质谱鉴定和量化PNGAse F-released N-连接糖基化结构。
2.5分子生物学
液滴数字 PCR (ddPCR) 使用 BioRad QX200 系统 (BioRad) 按照制造商说明并使用转座子特异性引物进行。引物和探针由 IDT 合成。使用 Cergentis 的靶向基因座扩增 (TLA) 进行转基因结构完整性表征和基因组整合位点鉴定。
3 结果与讨论
3.1 Leap-In 转座酶®系统
Leap-In transposase® 系统使用基于转座子的表达载体以及与之同源的转座酶。作为基于转座酶的基因转移系统的典型特征，Leap-In 转座子载体包含转座酶可识别的两个反向末端重复 (ITR) 序列。ITR 之间的基因序列是完全可定制的，没有大小或序列限制。对于细胞系开发应用，转座子的配置通常包含表达目标生物分子的开放阅读框、编码选择标记的基因以及在宿主细胞中高效表达所需的所有相关调控元件。这些元件的两侧是左右 ITR 和目标靶位点重复 TTAW（TTAT或 TTAA；图 1）。Leap-In 酶属于 DDE/D 整合酶家族 (Nesmelova & Hackett, 2010)。DDE/D 整合通过两步剪切和粘贴机制介导稳定整合 (Mitra et al., 2008)。为了设定它们在细胞内存在的时间限制，通过将Leap In mRNA 与基于转座子的表达构建体共转染，将转座酶引入宿主细胞。首先，在与特定的左右 ITR 结合后，该酶在侧翼的 TTAW 整合位点处引发双链断裂，并在释放的转座子末端形成短时间的 TT/AA 发夹中间体。然后，与 ITR 结合的转座酶识别合适的基因组靶位点，其特征在于位于开放染色质区域并有 TTAW序列的存在。一旦找到合适的基因组位点，酶就会在 TTAW 位点进行双链断裂，分解发夹，并整合转座子（图1）。
图1.转座原理示意图，Leap-In 转座酶介导的剪切和粘贴转基因整合机制（见文中解释）。为简单起见，仅显示 TTAA 识别标记示例。
转座子介导的表达载体整合到靶细胞基因组的优势包括：（i）ITR 之间的所有序列都忠实整合，没有缺失、插入或结构重排，以及（ii）当将转座子引入细胞基因组，每次插入都发生在单独的位置，因此不会引入可能易于重排或沉默的串联结构。为了确认 Leap-In 系统的转座插入了结构完整转座子的多个独立拷贝，我们分析了从三个独特的不同 Leap-In 细胞池中分离的克隆细胞系。每个细胞池都是通过对谷氨酰胺合成酶敲除的HD-BIOP3 中国仓鼠卵巢细胞 (CHO) （由Horizon Discovery 提供）共转染携带不同的 DNA的转座子质粒和Leap-In 转座酶 mRNA获得。每个转座子都包含编码抗体重链和轻链的基因、指导其高水平表达的调控元件和谷氨酰胺合成酶选择标记。转染 48 小时后，将细胞置于不含谷氨酰胺的培养基中，并在静态条件下孵育，直至细胞活力> 95%。为了评估转座完成后的基因组结构，从每个细胞池中分离出一个单克隆系进行Cergentis 执行的 TLA 分析(Hottentot et al., 2017)。
转座事件是通过在每一端寻找特征序列（TTAA 和 ITR）来识别的，如图 2 中的两个代表性示例所示。转座子转座到基因组会导致 5′-TTAA-3′ 靶位点（图 2 中的黑色字母）位于转座子两侧的 CHO 基因组（图 2 中的蓝色字母）中，两侧各有一个。两个靶位点之间是两个 ITR 序列（图 2 中的粉红色字母），它们之间是转座子的全部序列。质粒中的细菌元件（卡那霉素基因和细菌复制起点）不存在于转座子中，因此不存在于转座介导的 CHO 基因组整合位点中。相反，如果转座子通过随机片段化和非同源重组进行整合，则ITR 仍将在细菌序列中，在质粒内的某个位置会有断裂，并且断裂的两端将与 CHO 基因组序列相连。我们在三个克隆细胞系中鉴定了 108 个转座子整合（表 1）。在108 个整合中，每个细胞系中只有一个整合不具有图 2 中所示的结构，这表明在应用的转染和选择条件下，>97% 的整合是 Leap-In介导的转座。
图2.来自一个重组细胞的两个 Leap-In 介导的整合连接的核苷酸水平结构。蓝色：CHO 基因组序列，黑色：靶位点重复，粉色：转座子。CHO，中国仓鼠卵巢细胞。
表1.三个 Leap-In 介导的稳定、产生 mAb 的 CHO 克隆中基于转座的稳定整合的比例。
此外，TLA 分析表明，转座后的 Leap-In 转座子整合为单拷贝转基因，如图2所示。整合序列包括位于 ITR 之间的整个表达结构片段。通过转座整合的序列没有任何缺失、截断或转基因-转基因融合，并保持了表达构建体的原始配置。相反，通过非同源重组发生整合的所有三个位点都包含转基因-转基因融合。
Leap-In 介导的整合机制会使基因组中有多个转座子。每个整合位点仅包含一个转座子拷贝，并且转座子在核苷酸水平上是结构完整的。这与通过非同源末端连接整合的转基因形成鲜明对比，后者经常重新排列(Lattenmayer et al., 2006; Tharmalingam et al., 2018) 。本文介绍的研究中使用的选择标记衰减水平不支持通过随机整合建立的重组细胞的存活情况。
3.2基于 DHFR 筛选的 Leap-In 建立的 stable DG44 pool 呈现拷贝数依赖性表达
CHO细胞通常用于生物制造。两种流行的选择系统是采用无法合成关键代谢中间体的宿主细胞。比如DG44 细胞系缺乏 DHFR 酶的功能基因，这是合成嘌呤和胸苷酸所必需的(Florin et al., 2011) 。当随机整合方法与 DHFR 选择一起使用时，通常需要一个扩增步骤来将生产滴度提高到可接受的水平(Cacciatore et al., 2010) 。通过使用包含由弱启动子驱动的DHFR 基因的转座子，我们希望能够仅用一步就能选择出具有高转基因拷贝数的细胞池。
Leap-In 转座子结构被设计为包含抗体重链和轻链以及相关的表达调节元件以及选择盒的构造。通过将转座子 DNA 和转座酶 mRNA 共转染到CHO DG44 DHFR-/- 宿主细胞中，并在转染后一步中采用不同浓度的 DHFR 抑制剂 MTX 处理，采用存活的细胞建立了稳定的细胞池（stable pool）。一旦细胞池达到> 95% 的生存率（14-21 天，取决于选择严格性/Selection stringency），从样品中制备基因组 DNA，并使用 ddPCR 确定每个基因组的平均转座子整合数。图 3 显示随着 MTX 浓度的增加，观察到平均转座子拷贝数线性增加。因此，每个基因组整合的转座子的平均数量可以通过选择条件的严格程度来控制。
图3.在 HT 选择性培养基中培养的稳定 DG44 细胞池中的选择严格性和整合的 Leap-In 转座子拷贝数之间的相关性。在细胞池筛选的整个持续时间内，选择的严格性（selection stringency）由指定的 MTX 浓度控制，没有任何逐步的浓度增加。
使用具有进一步减弱的 DHFR 表达的转座子生成了几个额外的细胞池。同样也测量了这些细胞池的每个细胞的平均转座子拷贝数。然后在 25 毫升摇瓶规模的分批补料实验中确定每个细胞池的比生产率。在每个细胞的平均整合转座子数和相应的特定产物的产率之间观察到强线性相关性 (R2 = 0.84) (图 4)。
图4.在不同选择严格度下建立的 CHO DG44 稳定池中转基因拷贝数和比生产力之间的相关性。CHO，中国仓鼠卵巢细胞。
整合到 CHO DG44 基因组中的转座子数量的增加导致细胞池的生产能力成比例增加，这是拷贝数依赖性表达系统的一个特征，并且说明转基因表达盒是忠实地整合到基因组中，并与周围的基因元件相隔离。它还表明，平均而言，通过转座进行的每次整合都保持了转座子（LC、HC、调节元件和选择盒）的功能完整性，而没有有害的重组或沉默。
3.3由 GS-/-CHO 细胞建立的 Leap-In 转座酶介导的稳定细胞池
我们设计了具有五种不同谷氨酰胺合成酶盒的 Leap-In 转座子，其中谷氨酰胺合成酶表达水平逐渐降低，从而逐渐增加选择的严格性，顺序为 h+、ht、ht+、hxt 和 hxt+。合成编码抗体相同重链和轻链的开放阅读框，并克隆到这五个转座子中。重链和轻链受相同的基于 EF1α 启动子的调节元件的控制，两侧是相同的 HS4 和 D4Z4 绝缘子；因此，五个转座子仅在谷氨酰胺合成酶选择盒中有所不同。将转座子与Leap-In Transposase mRNA 共转染到 GS 敲除细胞中。随后通过在转染后 48 小时将细胞转移到不含谷氨酰胺的培养基中来建立稳定的细胞池。在选择过程中没有使用额外的选择压力（例如，添加 MSX）。图 5a 显示了五个细胞池的生存能力选择曲线。
图5. (a) 在无谷氨酰胺培养基中稳定细胞池选择过程中，用不同选择严格性转座子转染的GS KO 细胞的活力。(b, c) 在不同选择严格度下建立的五个 Leap-In 介导的稳定细胞池中，整合转座子拷贝数与比生产力 (b) 和体积生产力 (c) 之间的相关性。
生长恢复后，分析每个池的平均转座子拷贝数，并进行 10 天的分批补料培养。具体生产能力和拷贝数见表2。
表2.第 10 天的体积生产率、计算的比生产率和整合的转基因拷贝数。
被赋予最不严格 (h+) 选择的转座子的细胞池在不到一周的时间内恢复到 >95% 的活力。具有三个中等严格度（ht、hxt 和 ht+）的细胞池在大约 12天内已达到 95% 的存活率，但最严格的 (hxt+) 选择需要大约 20 天才能恢复。类似于基于 DHFR 的选择（图 4），选择严格性、整合的转基因拷贝数和细胞池的特定生产能力之间存在相关性（图 5b）。
这些数据显示， Leap-In 介导的稳定 GS 细胞池与通过随机整合建立的细胞池其特性显著不同，后者无法建立前述的各种相关性(Noh et al., 2018) 。引人注意的是，单位体积的生产能力与拷贝数密切相关（R2 = 0.97）（图 5c），这进一步将依赖拷贝数的 Leap-In介导的表达与随机整合系统区分开来。
3.4 Leap-In 细胞池的克隆分布偏向于高表达克隆
将单细胞置于 96 孔板中（每个细胞池一个板），单克隆系来自表 2 中列出的四个最高产细胞池。我们观察到，在相同的克隆条件下，我们从更严格的选择中能获得的存活克隆逐渐减少（表 3）。扩增后，这些克隆的生产能力在 24 孔深孔板的 7 天补料分批培养后进行测量。生产率分布如图 6 所示。
表3.分析图 6 中显示的数据以显示生产率分布。对于每个细胞池，Q1 是产量为最高克隆产量的 75% 到 100% 之间的克隆数量占比。类似地，Q2 是50% 到 75% 之间的克隆数量占比，Q3 是25% 到 50% 之间的克隆数量占比，Q4 是0% 到25% 之间的克隆数量占比。
图6.从表达相同的单抗，但在不同选择严格度下建立的四个稳定细胞池中所分离出的克隆的生产能力。在 7 天 24 孔深孔板规模补料分批培养结束时，通过 Octet 测量生产能力。
前三个库中最高表达克隆的生产能力相似，在 7 天分批补料培养中约为 2 g/L。有趣的是，来自最严格 (hxt+) 选择的最高表达克隆产量为略高于 1.5 g/L，明显低于来自其他三个细胞池的顶级克隆。基于这些观察，在我们当前的平台选择系统中，通过中高严格的选择条件建立的 Leap-In 稳定细胞池是分离克隆细胞系的首选。
我们将四个细胞池的克隆生产能力的范围进行四等分并将各个克隆根据生产能力分类到这些四等分的范围中，可以观察到具有选择严格性相关的趋势（表 3）。选择严格性与 Q1 分数直接相关。相对较小的 Q3 和 Q4 分数与选择严格性显示出小的负相关。组合的 Q1 + Q2 部分占所有克隆的 >75%，在 Leap-In 生成的稳定细胞池中具有显著的偏向于高生产细胞克隆的特征。
表 3 和图 6 中的数据表明，采用Leap-In 生成的稳定细胞池中，即使在中等严格度的选择条件下，在不到100个稳定单克隆中就足以挑选出高生产能力的克隆。相比之下，采用随机整合细胞池需要筛选出数千个克隆才能成功进行细胞系的构建(Le et al., 2018) 。Leap-In 介导的稳定细胞池的独特克隆分布将克隆筛选需求降低了一到两个数量级，从而大大降低了资源需求。
3.5 Leap-In 转座子在 CHO 基因组中是稳定的
遗传稳定性是商业生产细胞系的关键质量属性（CQA），但目前主流的随机整合机制无法控制甚至预测遗传稳定性。在使用基因扩增方法时，高频的重排串联转基因整合体现象经常加剧，导致形成遗传上不稳定的重组基因座。
我们分析了来自多个外部和内部研发计划的 80 多个克隆的遗传稳定性。为此，在有和没有选择压力的情况下，将细胞传代 60 到 90 次群体倍增，通过ddPCR 评估综合拷贝数以及对来自代表性的生产培养物的生产能力进行评估。结果表明，由 Leap-In 转座子建立的克隆中 >90% 保持 T0 的生产能力和拷贝数水平（图 7a，b）。在剩下的<10% 的克隆，生产能力下降程度少于 T0 值的30%，该值通常被认为符合行业内可接受的稳定性范围。简而言之，在 Leap-In 介导的细胞系开发计划中，良好的遗传稳定性进一步减少了开发计划期间处理和分类所需的克隆数量。
图7. (a, b) Leap-In 稳定克隆中拷贝数和生产能力的稳定性。
我们还对一个超过 90 次倍增的克隆的遗传稳定性进行了更深入的评估。使用来自 Cergentis 的 TLA 技术(Hottentot et al., 2017) 进行的重组转基因插入检测获得核苷酸序列水平数据。在 T0 和 PD90 时间点分析的细胞中检测到 58 个转座酶介导的整合位点。更重要的是，它们的侧翼基因组序列在两个时间点是相同的。整合位点被映射到宿主基因组上，并且在两个时间点都位于完全相同的位置，这表明 Leap-In 转座酶介导的稳定整合具有非常好的结构稳定性。
3.6 Leap-In 细胞池和克隆的产品具有高度可比性
克隆生产能力的更均匀分布意味着细胞池滴度和克隆滴度非常具有好的可比性。换句话说，Leap-In 细胞池可靠地预测了它们的衍生克隆的生产能力。表 4 中列出了来自九个不同项目的数据。这种高度相关性意味着细胞池原则上可以用于早期工艺开发工作，甚至在单细胞克隆开始之前。这也意味着可以筛选使用各种载体元件、链比率、编码序列等，并确保建立的细胞池的性能可以预测衍生克隆的性能。
表4. Leap-In 介导的稳定细胞池和衍生克隆生产能力在各种细胞系开发 (CLD) 程序中的比较。
稳定细胞池和克隆的可比性不仅限于生产能力。这里，使用表 2 中描述的三个细胞池（ht、hxt 和 ht+）和图 6 中的克隆用作模型。我们研究了生产相同单克隆抗体的三个 Leap-In 介导的稳定池和随机分离的、衍生的高产能克隆的两个全局物理化学 CQA：电荷分布（图 8a）和 N-连接的糖基化分布（图 8b）。
图8. (a) 建立在不同的选择严格程度下的三个稳定细胞池以及它们的衍生克隆产生的碱性、主体和酸性电荷基团的分布比例。数据表明稳定细胞池和衍生克隆之间存在很强的电荷分布的可比性。(b) 三个稳定细胞池和衍生克隆中的 N-连接糖基化分布。
图 8b 中的数据显示了三个稳定细胞池和衍生克隆中的 N-连接糖基化分布。其中有2个选择严格度较高的池与其衍生克隆的糖基化谱是相当的，而从较低严格度库中分离的克隆在 N-糖基化组成方面表现出更多的多样性。这一观察结果可以指导选择严格性的选择，这取决于对同质或不同糖基化结构的偏好程度。
3.7Leap-In 细胞池足够稳定，可用于工艺开发和生物制品 DS 制造
基于它们的生产能力和产品质量的可比性，Leap-In 建立的稳定细胞池可以被认为是其衍生的最终克隆的代表性细胞基准物。这表明这些细胞池可用于支持工艺开发、分析开发和供 IND 使用的毒性检测。这些进程可以和确定最终克隆的进程同时启动，从而缩短 CMC 开发时间。
如前所述，单个 Leap-In 克隆表现出显著的遗传稳定性。然而，驱动群体动态的固有克隆生长差异可能会随着时间的推移改变稳定细胞池的克隆分布。为了评估群体动态的变化是否允许将细胞池用于代表性原料药制造，图 5 中展示了三个相同稳定细胞池在无谷氨酰胺培养基中进行了 30 次群体倍增的标准稳定性传代研究。在传代结束时，使用时间 0 和 PD30 细胞池进行补料分批生产，结果如图 9a-c 所示。
正如预期的那样，与 T0 对应物相比，PD30 细胞池中的容积生产率较低。生产能力下降的程度与第 1 区中包含顶级生产能力的克隆比例成反比（R2 = 0.99，数据未展示）。然而，在所有三个细胞池中观察到的生产率变化都小于 25%。这低于公认的克隆稳定性约 30% 的生产力损失接受标准。
研究也对 T0 和PD30 细胞池产生的产物的电荷分布和 N-连接糖基化的可比性进行了分析（图 9b，c）。
图 9b、c 中显示的数据表明 T0 和 PD30 池之间的产品质量可比性很高。从一瓶 10E7 细胞开始，进行 30 次群体倍增，足以接种 5000 升的生物反应器，以每升若干克的产量，将产生千克级的原料药。这些数据显示Leap-In 系统可以作为其他方法的可行替代方案，旨在利用稳定的池来缩短 CMC 开发时间。
图9. (a) Leap-In 稳定细胞池的容积生产率。灰条：时间 0，黑条：PD30。箭头表示以 T0 值的百分比表示的生产率变化。(b) T0 和 PD30 稳定细胞池之间的电荷分布可比性。(c) T0 和 PD30 稳定库之间的 N-连接糖基化可比性。
3.8总结
与传统的基于随机整合的技术相比，Leap-In 转座酶介导的稳定细胞系开发提供了一系列有价值的特征，包括遗传稳定的、高比率一致性的多顺反子单元整合的高表达水平的稳健细胞池，以及细胞池——克隆生产能力的一致性和产品质量的可比性。
Leap-In 介导的稳定整合体的结构和功能完整性将得到更均匀的稳定细胞池，其中约97% 的重组整合位点为单个的表达构建体的精确拷贝。因此，Leap-In 介导的稳定细胞池与其衍生克隆之间具有很强的生产能力和产品质量的可比性。
这种特征细胞池与克隆之间的可比性使开发程序能够及早消除风险。这是通过筛选多个具有代表性的预测稳定细胞池来实现的，以获得最佳生产能力和产品质量，从而改变传统的制造细胞系开发模式。细胞池排名阶段的生产能力和产品质量可靠地预测了最终克隆的生产能力和产品质量范围。一旦确定了最佳稳定细胞池，只需筛选和排序少量 (<100) 的克隆，即可分离出具有所需生产能力和 CQA 特征的遗传稳定克隆。Leap-In 介导的细胞池可以比在其他地方描述的替代性、工业相关的表观遗传调控元件（包括 UCOE、绝缘体和 MAR）的使用，富集更多高生产能力的克隆(Saunders et al., 2015) 。
与传统表达技术建立的细胞池不同，Leap-In 稳定细胞池保持遗传、生产力和产品质量的稳定性。细胞池的这种独特稳定性使其能够及早高效地生产用于分析和配方开发研究的代表性药物物质以及用于毒理学研究甚至 I 期临床试验的材料。此外，基于它们的生产能力和强大的遗传稳定性，Leap-In 介导的稳定克隆是支持基于灌注的制造过程的有吸引力的潜在候选者，在该制造过程中，除了解决工程化和后勤工作的挑战之外，开发最适合扩展操作模式的生产克隆也是一项关键任务(Bielser et al., 2018) 。
总之，Leap-In 介导的细胞系开发工作流程可实现高生产能力、可预测的产品质量、强大的遗传稳定性，并缩短 CMC 开发时间，显著减少资源消耗。
参考文献
Biotechnol Bioeng. 2021 Jun;118(6):2301-2311. doi: 10.1002/bit.27742. Epub 2021 Apr 2. 阅读原文