简介
Celonic AG公司成立于1982年，是一家专业从事用哺乳动物细胞株生产高端生物制品的CDMO企业，公司有两个地点：瑞士巴塞尔主要从事CLD等开发工作，德国海德堡则负责GMP生产。
优化CLD流程的需求
经常都有来自世界各地的客户委托Celonic的CLD部门建立稳定的细胞株，用来生产各种各样的蛋白：从经典的单抗，到双特异抗体和难表达的融合蛋白。直到2018年初，整个过程都还很漫长，从收到序列开始到分批补料筛选出Lead克隆大约需要29周，需要处理多达500块96孔板，这常让CLD工作人员疲惫不堪。因此部门非常期望在保持工艺质量的同时可以大幅降低这两个参数，同时还能提高其主细胞库(MCB)克隆起源证据的可信度。
开发更短的工作流程并减少FTE时间
通常来说,用随机整合的方法建立一个生产目标蛋白的有克隆起源（clonally derived）证据的高产株,至少要筛到一千个克隆，方能有高的概率得到最佳生产克隆。之前公司的CLD部门先用minipool的方法做一步富集，这尽管有效但过程漫长，需要接着做有限稀释来确保克隆性（clonality assurance）；此外人工和耗材等后勤消耗也非常之大，需要处理数百块96孔板来得到足够多的（1000+）候选克隆。为了缩短工作流程,显著提高得到高产株的机会,并降低FTE工作量(Full-time Equivalent，全职工作等量),除了有效的细胞富集的方法来减少要去筛选的克隆数量外,团队也需要单细胞铺板的新方法，让铺板的效率高并且铺板后细胞还能长得好。此外，用板量的减少也让进行更多次的全孔成像成为可能，在客户未来提交的监管申请里能够提供出更完整的克隆历史记录。
液体处理需要温和
该部门先前购置了一台流式细胞仪 (BD FACS Aria)，用于更快地富集高产克隆并替换之前漫长的minipool过程。虽然FACS可以批量分选和富集高产细胞,但Celonic用的CHO K1衍生的悬浮细胞(23-CHO-S)却扛不住FACS的剪切应力，在96孔板中做单细胞分选时，细胞的存活率和生长率都低。
“我们采用流式细胞仪能够快速地富集转染细胞群，但做CHO细胞时并不算完全成功,由于细胞活力的问题我们不能再直接用FACS去做单细胞铺板，还是在靠有限稀释法铺板产生100块板子来得到约1000个候选克隆,而这里面很大的一部分其实还并不是克隆的” Celonic 的CLD科学家Camille Evenou解释说。
引进VIPS™ 和 Cell Metric®后效果显著
“VIPS™非常独特,是市场上仅有的单细胞克隆系统，能够通过高分辨率(z-stack)成像追踪进入真实孔内的单个细胞，还具备Cell Metric®的功能，可以进行后续的日常全孔成像”，Evenou解释道。
该公司于2018年年中购买了VIPS和Cell Metric，并迅速投入了使用。很快，VIPS温和、低压力的液体处理方式就显示出了对用户的价值。在测试的第一周，铺板效率就令人印象深刻，与FACS相当(约80%，数据没有显示)故无需再做优化；更令人瞩目的是，其细胞生长率（outgrowth）比FACS提高了2-3倍(图1)。
图1 -CHO细胞生长率的比较：单细胞铺板FACS v.s. VIPS（仅使用基础培养基及无补充剂添加）；生长率-长出细胞群的克隆孔占比。
培养基优化的重要性
初战告捷后，研究小组在VIPS上又接着试了几种不同的铺板培养基和补充剂，以期对克隆的生长率做进一步优化。优化的效果显著，在不影响铺板效率的情况下，单细胞的生长率增加了一倍以上(见图2)。
图2 -在VIPS上测试不同培养基和组成对生长率的提高;生长率-有细胞群长出的克隆孔的占比。
更有力的克隆起源细胞群（clonally derived population）证据
做细胞株开发用于生物制品生产时，如果没有数据可证明其克隆起源，这样的高产株并没有什么价值。因此，CLD的工作流程几乎就是在提供MCB的克隆起源证据。在做一轮克隆结合影像证据时，证据的主要标准通常是要有高质量的全孔图像，可以清晰地显示孔中有且只有一个细胞并在未来24小时左右发生了分裂。
因为得到同样数量的候选克隆而所需铺的板子少了 (之前LD要用到100块板，VIPS现在只需20块),CLD部门现在可以对铺好的板子更频繁地进行日常成像(现在拍10个时间点，之前只拍4次),可以记录出一个更完整的时间进程(见图3)。这步优化可以确保在每孔中的每一次的分裂都能被记录，而这在要做大量板子的以前是不可能的。现在部门铺完板后每天可以轻松地拍上两次,更方便是VIPS和Cell Metric全孔成像仪间还可以相互通信和共享数据,完整提供出每个克隆的来历并建档，形成一个增强版的克隆性报告提交给内部或外部的监管部门。
“有了VIPS/Cell Metric软件生成的这种增强版的克隆性报告，我们能在单细胞刚进入孔内时就追踪细胞及可能的细胞碎片，直至其完全生长成细胞群，现在对所建的每一个细胞株，我们都能给客户提供一个单独的精心制作的文件，这个报告具备完整的可追溯性并符合监管部门有关的审计追踪要求。”Evenou总结道。
讨论
Celonic结合应用VIPS和Cell Metric获得了成功，他们现在可以快速并持续地向客户交付高产细胞株，并同时提供符合各个监管机构要求的，最完整的克隆起源MCB细胞群（clonally-derived MCB population）的证据文件。在后勤消耗方面,新设备的采用则减少了FTE时间，让工作流程大大缩短(上ambr前13周即得到候选top克隆)和不再繁重(见图4中总结),这也让Celonic在保证质量的前提下能在同时期扩展和承接更多的客户项目。
图4 -使用minipools和LD的旧工作流程(上部)与新的工作流程（下部，使用FACS进行富集和用VIPS做单细胞克隆步骤)的比较。
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