为什么在CRISPR研究中细胞系的克隆纯度非常重要?

为什么在CRISPR研究中细胞系的克隆纯度非常重要?

前言

2015年Science的一篇报道引起了轩然大波。

几十年来，科学家使用的细胞系中有20％到36％被污染或被错误识别–作为人体组织细胞的研究，实际上来自猪，大鼠或小鼠，或者其中所需的人类细胞被未知的其他细胞污染。涉及的一种细胞系是HeLa细胞，事实证明HEp–2和INT 407，现在已经被HeLa细胞污染，这意味着正在研究HEp–2和INT 407的科学家，实际上可能正在研究HeLa细胞。

图片来自：Science  27 Feb 2015:Vol. 347, Issue 6225, pp. 938–940

那只是两个细胞系。总而言之，超过400种细胞系缺乏来源证据。

国际细胞系认证委员会主席Amanda Capes–Davis在Retraction Watch的文章中写道。“当细胞首次进入培养时，它们通常会在细胞系出现之前经过一段很短或没有生长的时间，在那段时间从其他地方引进的单个细胞可能会超过原始细胞的种群，但是没有任何人意识到细胞系身份的变化。“

一些期刊如Nature及其子刊现在要求作者提交相应的证据，证明他们所使用的细胞系。无论如何，这可以防止污染的细胞进一步扩大。

我在用的细胞系靠谱吗？对这个问题想当然是危险的。细胞系的克隆纯度，即单个细胞起始而来的实验流程和验证，在如CRISPR的热点研究工作中，由于编辑错误或脱靶效应会带来更多的风险，尤其显得重要。

为什么在CRISPR研究中细胞系的克隆纯度非常重要?

CRISPR/Cas9由两部分组成:Cas蛋白(通常为Cas9)和向导RNA (gRNA)。当gRNA与目标DNA序列结合后，Cas蛋白在目标位点产生双链断裂。在这一断裂点上，研究人员可以敲除目标基因的表达或“敲入”替代的DNA。

实际上这一过程很容易出错，比如基因不完全敲除或未转染（成功敲入），得到的细胞往往是携带各种非预期背景突变的混合群体。因此，能够分离出单个细胞克隆并通过序列予以验证是非常必要的。

图示：CRISPR/CAS9

传统的细胞系开发方法包括有限稀释法和用流式细胞仪，但都有其硬伤。有限稀释法耗时低效，流式细胞仪则对细胞活力伤害很大，分离出的细胞存活率低；此外，两种方法提供的细胞单克隆源性证据要么是通过概率来预测的，要么就还需要整孔成像来验证。如果要用可靠的细胞株进行疾病模型和靶点验证研究，就必须证明细胞株的克隆性，即从单个细胞起始而来。在药物发现和细胞治疗的研究中，一些最有趣的细胞类型，例如iPSC细胞，往往也是最难分离出单个细胞，并能成功生长的细胞类型。

Solentim的VIPS™是一种独特的一体机，它将单个细胞铺板到96孔板中，以不到1 psi的压力喷射纳升级的液滴，能够实现不错的细胞存活率和很高的铺板效率(通常的细胞类型超过80%的孔中都只有一个细胞)。同时，温和的细胞分配方式也不会影响细胞的正常表型。这个设备不仅提高了效率，节省了研究人员的时间和金钱，还能够验证细胞株的单克隆源性。当细胞液滴分配到干燥的孔底时，设备会对液滴进行片层成像分辨出单个细胞，液滴和随后拍摄的整孔图像证据都将包含在克隆源性报告中。这样的单克隆源性档案是制药公司对细胞株进行内部建档的重要组成部分，并支持未来潜在的知识产权。