编者前言
细胞株的成功开发对基于CHO细胞的生物制品生产至关重要。要做到这一点，企业需要通过克隆筛选找到具有良好生产潜力的细胞株。候选的克隆需要稳定、高产，并具有产品所需的特性。为了选择最好的细胞株，企业常常产生大量的克隆用于筛选。
上述工作中的一个挑战是确保板子中单个细胞的良好生长，这常常需要对工作流程进行优化，确保筛出最好的和产生足够多的克隆。
继上期公众号后，本期继续讨论这个问题。下面的Blog提供了一个优化单细胞生长的指南，并附录了相关的采访记录。
优化铺板后单细胞生长：一些关键因素
Dr. IanTaylor, Chief Commercial Officer, Solentim
在开发生物治疗药物的过程中，许多阶段都需要进行优化。细胞株开发是这一过程中重要的上游阶段，有很多因素都会显著影响时间线（time line）和结果。
对许多客户来说，一个关键领域是单细胞铺板后的生长，如果没有做条件优化，铺板的高效率常常不能转化为筛选所需的大量克隆。
需要优化的一些关键因素
细胞株的选择
这是首先需要考虑的因素，通常的选择有:
1. 公共来源的CHO
2. 有专利的商品化细胞系；如Millipoma, Horizon, Lonza, Celonic
3. 自主研制。
大型制药公司一般会选择自主开发细胞株，小中型公司通常会选择商用细胞株。选择去购买或授权使用的细胞株的好处是，它们通常带有明确的培养基和添加物的组分和介绍。用经过验证的“交钥匙”方案和设备去做关键的步骤（如单细胞铺板和生长监测）可以让这些商品化细胞株的方法切换来的更加稳健。
目前这种许可模式的财务负担已经变得不那么繁重，使用费低了很多，基于专利的负担也减轻了不少。
基因编辑技术的选择
在铺板之前，需要确定细胞株是稳定的，并且所选择的方法可以让GOI（外源基因）准确地插入宿主基因组中。例如，我们之前讨论了ATUM转座酶技术，该技术具有高表达水平和高克隆稳定性（链接：VIPS应用报告：从不到200个克隆中筛选出商用生产细胞株）。在充满挑战的整个工艺流程中，将一个经过编辑、产量高的克隆成功地铺到板孔中只是一个开始。
单细胞的铺板方法
对单细胞铺板设备，主要考虑单细胞转入孔内时的分配压力。如果压力过高，细胞到达时就会受损，从而影响细胞的存活。Solentim公司的VIPS分配细胞时压力比FACS系统低很多（1 psi），可以提高细胞存活率，促进生长和增加克隆效率。在Solentim最近发表的关于Janssen使用VIPS的案例研究中，该设备显示具有与手动稀释相当的生长率，而观察到有生长的可用孔数增加了68％（链接：应用VIPS,杨森将细胞系开发所需的时间缩短了一半）。
VIPS铺板示意。
很多案例已经验证VIPS在实际工作中运作良好，如有客户使用Horizon‘s和MilliporeSigma的商品化CHO细胞株与VIPS结合使用所展示的结果（链接：提高铺板后单细胞的存活生长率）。
生长培养基和补充剂
依不同的铺板方法，可以将单细胞分配到预先加有培养基的孔中（如FACS流式或SCP“单细胞打印机”）；或如VIPS，先把单细胞分配到干孔中，最后再自动加入培养基。商品化培养基可以从多个供应商处购买，而进一步使用促生长补充剂可以提高细胞的存活生长率。
Solentim最近宣布与SAL Scientific合作解决这个问题。该合作将提供新型培养基补充剂以改善细胞生长。在化学成分确定的无动物成分培养基中，细胞生长和增殖的能力容易受损，尤其是在受到压力时。SAL公司的‘Insti‘系列细胞培养基补充剂已被证明可以改善细胞生长，促进集落形成和提高克隆效率。这些补充剂适用于CHO和HEK细胞。详见图1结果，采用CHOZN商用细胞株。
图1：客户结果示例，比较CHOZN细胞生长。手动稀释（LD）与VIPS+/–InstiGRO的比较。VIPS+InstiGRO显示的生长率大约是最初的7倍。结果是每个板子中细胞的总生长率。
作为一种培养策略，一些客户也会先将细胞分配到较小体积的培养基中，几天后再添加培养基。添加的的培养基可能与最初的培养基不同，其作用是在细胞第一次分裂后支持细胞的生长。
无论如何，有一个基本要求是培养基和任何补充剂都不要含有动物成分，此阶段的培养基也不同于最终生产时所用的培养基。针对细胞生长，一些客户也常使用条件培养基。
实际上，目前还没有一种方法能够满足所有条件，都需要独立地对特定得表达蛋白去尝试相应得细胞培养条件，即便使用推荐的培养基，一些关键成分的改变和添加补充剂都可能获得更高的产量。
孔板和工作体积
孔的尺寸和孔内液体的体积也是一个考虑因素，我们发现许多客户已从96孔板转移到384孔板进行克隆，较小的孔体积似乎有利于细胞复苏，从而更好的生长。
我们也注意到，有时单个细胞在铺板后的最初几天分裂了，但之后就停止了，其原因尚不清楚，可能与克隆不稳定有关。
用于监测细胞生长的成像仪
整孔成像仪可以提供孔内细胞生长和单克隆源性的关键信息。
在克隆板上通过非侵入的明场成像来评估生长，测量confluence或“总细胞数”，然后在振动培养板、试管和按比例缩小的微型生物反应器中通过“活细胞数”(用于测量效价)进行扩增。
CellMetric等仪器在单细胞克隆和克隆筛选过程中成像，研究人员可以在原位监测整个孔的生长情况，为每孔提供生长速率曲线和合流百分比（percentage confluence），并能追溯至单个细胞的起始。如果大多数克隆不能分裂和生长，那么即便有高的铺板效率也没有什么用处。良好可靠的生长指标可以让研究人员在工艺早期做出决策，并有信心在更少的板子中培养更少的候选克隆，最终节省时间和预算。
总结和建议
本文远非详尽无遗，仅涉及了细胞存活和单细胞生长优化的部分关键方面。建议最好是采用一个商品化CHO细胞株的主流供应商，他们可以提供建议和各种protocol，让您快速上手。
而且，想要在转染不同的表达分子后获得最佳的结果，使用温和分配细胞并提供高存活率的设备（例如VIPS），以及优化培养基和添加补充剂，这些措施能这些细胞株的生长和产量翻番。
Solentim最近公布的结果显示，通过调整背景培养基，以及添加一种新的商品化无动物成份补充剂，HD BIOP3和CHOZN细胞株的生长率都得到了改善。
专访Solentim公司首席商务官伊恩·泰勒博士
为什么你觉得细胞生长如此具有挑战性?
从根本上讲，单细胞不“喜欢”单独生存在相对较大的体积中，它们“挣扎”着分裂和生长为克隆。由于这一潜在的限制，你需要铺更多的孔板，以获得足够数量的克隆。
您已经列出了一些优化因素。对于企业应该如何进行这种优化，您有什么建议吗?比如企业的时间只够做有限的项目时，哪些因素是最重要的?
我建议首要考虑靶向整合的载体（vector)和宿主细胞的优化
您提到了与SAL Scientific合作提供新型细胞培养基补充剂，旨在促进细胞生长。你能告诉我们更多关于产品的信息吗?这对克隆细胞优化有什么影响?
是的，这些现在都能在我们的网站上查阅。InstiGRO产品用于克隆板中CHO和HEK细胞的生长。
你能给读者描述一下，像Cell Metric这样的仪器，如何用来监测细胞生长的（首先可以检测细胞数，然后是confluence和集落计数），以及仪器如何能提高整个细胞株开发的效率？
VIPS与Cell Metric的结合意味着我们可以在纳升级的体积中分离单个细胞，然后根据FDA的要求在整板中确认单克隆源性。我们可以在克隆源性报告中跟踪细胞的分裂和生长速度，克隆的单细胞起源和生长的电子记录都包含在IND文件中。