miFuc 平台降低任何细胞系内的核心岩藻糖

miFuc并不去触及CHO等宿主细胞，而是仅仅在载体上做改进，从而降低基因表达水平，最终达到去岩藻糖的目的，其特点和优势有：

1.通过表达载体实现去岩藻糖化，操作简便且不限制细胞系；

2.基于Leap-In 转座酶平台，基因重组更稳定、更高效；

3.Pools的糖基化水平与候选细胞株一致性高，缩短开发时间；

4.去岩藻糖化显著，但不影响总糖。

抗体糖基化与ADCC/CDC

众所周知，抗体的岩藻糖基化水平强烈影响ADCC活性。研究已知低岩藻糖基化的抗体会对NK细胞上FcγRIIIa（CD16a）的有更强的亲和力，能更好地结合，甚至活性差别高达100倍。抗体的糖基化修饰位点位于Fc端，通常是Fc受体(ADCC机制)和C1q (CDC机制)的结合位点。通过结构分析显示，Fc结构域中Asn 297处的N-聚糖岩藻糖基化是特别重要，岩藻糖残基在空间上阻碍了抗体Fc结构域与CD16a的相互作用。

IgG1的糖基化以岩藻糖(Fuc)为核心，再由N-乙酰氨基葡萄糖(N-GlcNAc)分出两条等长的分支，其分支上伴以甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)和唾液酸(Sia)，由此构成IgG1的Fc端N位糖基化。根据两条分支中的单糖不同，可分为表1中的不同糖型，正是由其糖型的不同导致单抗的免疫原性、生物活性、药物动力学等的不同。

表1 IgG1的Fc端糖基化修饰类型（注：N-Acetylneuraminicacid，N-乙酰神经氨酸即唾液酸）

糖基化是个复杂的过程。虽然在培养基中补充2-F-过乙酰基岩藻糖（2FP）可抑制岩藻糖转移酶8（FUT8 ），从而使mAb 中的岩藻糖基化降低多达75％，但是总体来看在细胞培养过程中难以控制。因此为了获得去岩藻糖的抗体，都是从CHO表达系统着手改进的，常见的如通过敲除CHO细胞中岩藻糖转移酶基因（Fut8），或敲除GFT基因（GDP-岩藻糖转运蛋白），其目的都是阻止抗体在高尔基体中发生岩藻糖基化修饰。但是改良并获得这类稳定细胞系是个技术难点，此外常常也有专利的限制。

已上市的去岩藻糖基化抗体药物

已有去岩藻糖基化的单抗药上市，如日本麒麟药业的Mogamulizumab（莫格利珠单抗），2012年在日本批准上市，为靶向CCR4的人源化单抗，适应症主要为重症血液疾病。其通过同源重组的方式，对CHO细胞中的FUT8进行干扰，降低岩藻糖基化比例，从而提高了ADCC效应。

又如罗氏制药的Obinutuzumab（奥比妥珠单抗），2013年FDA批准上市，靶向CD20的人源化单抗，适应症为慢性淋巴细胞白血病和滤泡性淋巴瘤。通过在抗体制备的过程中过表达N-乙酰氨基葡萄糖转移酶3和高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ，大幅降低岩藻糖基化，ADCC效应随之增强几十倍。

几种降低岩藻糖基化的策略和特点

1.CHO宿主细胞改造

通过基因编辑（TALEN, CRISPR/CAS9, ZFNase等）敲除或者敲低 FUT8或相关功能基因，从而达到去岩藻糖化的目的。但商业化成本较高，相关技术均存在IP壁垒；可能需要更换CHO细胞系。

2.下游工艺调糖

通过相关培养工艺，可实现糖基化的调整。但其工艺优化较为复杂，不同类型的糖基化、不同的位点难以控制且相互影响；此外，调整空间也较为有限。

3.通过导入相关基因抑制/降低糖基化水平

本策略从操作性上优势非常明显：首先，不依赖于宿主改造，避开了相关IP 壁垒，成本较低且容易实现；此外，无需更换已有CHO细胞系，并且由于基因整合进入CHO 基因组，糖基化水平可长期稳定。这也正是miFuc技术平台所采取的策略。

ATUM公司miFuc技术平台

ATUM公司基于Leap-In转座酶平台，开发了miFuc技术，为去岩藻糖的研究提供了不同的思路和解决方案。令人振奋的改进是，miFuc并不去触及CHO细胞系或其它宿主细胞，而是仅仅在载体上做改进，从而降低基因表达水平，最终达到去岩藻糖的目的。并且，其细胞株糖基化水平更稳定，更能适应抗体药物的生命周期。

由于Leap-In转座酶平台的特点，产自此平台的细胞系，基因拷贝和蛋白表达都非常稳定，所以经miFuc技术改良的细胞同样继承了表型稳定的优点。

miFuc的应用，不仅保证了基因传代的稳定性和蛋白表达的重现性，而且可以搭配多种载体，并兼容于各种宿主细胞系。在不更换细胞系及细胞培养条件的情况下，较少的改变就有机会降低岩藻糖基化，增强ADCC的活性。

关于ADCC和CDC

单克隆抗体 (mAb) 治疗癌症或自身免疫性疾病中，抗体发挥效力两个主要机制分别为抗体依赖的细胞毒性作用(Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)和补体依赖的细胞毒性作用(Complement-dependent cytotoxicity，CDC)。

ADCC的作用机制是抗体的Fab片段结合靶细胞的抗原表位, 同时其Fc 片段与杀伤细胞如NK细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等表面的Fc受体(FcR)结合, 介导杀伤靶细胞。在这些杀伤细胞中, NK细胞是介导ADCC的主要细胞，细胞表面上的FcγRIIIa（CD16a）对触发细胞毒性起到关键作用。

CDC的作用机制是抗体的Fab段结合靶细胞的抗原表位,同时其Fc段与补体C1q结合, 接着激活C2-C9补体系统, 在靶细胞表面形成攻膜复合物, 导致细胞的裂解。

参考文献：

Rajendran et.al., Biotechnol. Bioeng., 2021,118(6):2301-2311