单克隆验证方法的重要性
关于基于单细胞成像仪的细胞株开发方法学验证的一些疑问、思考与讨论
随着细胞株开发（CLD）流程的不断优化和新仪器技术的引入，基于单细胞成像仪的CLD被国内外生物医药企业广泛地采用。自2015年以来，笔者一直和国内细胞株开发领域的一线工作者保持紧密联系，亲历了工艺改变和进步的整个过程。
本文就目前普遍遇到的一些疑问，以及未来可能会碰到的问题，提出一些个人的探讨，分享一些自己的想法，更希望通过抛砖引玉，能有机会和各位专家和老师们一起讨论完善。
本文谈及的相关内容，仅作内部交流，如果具体涉及申报方面的考量，请以法规评审意见为准。文中可能会涉及一些文献引用，小编尽量表述清楚，如有涉及引用/表述不当或涉及侵权，请与我们联系。
Q: 涉及细胞株单克隆性有关的法规有哪些？有哪些指导意见中含细胞株单克隆筛选的方法表述？
A：目前生物制药中以哺乳类细胞（主要是CHO）作为表达体系的，最主要的参考法规文件为ICH Q5D，当然也有包括FDA/EMA和NMPA等各国家法规监管部门出台更为详细的规定，各国要求在部分细节上要求会有差异，但大体上都遵循了ICH Q5D原则。
在具体操作上，通常法规文件不会进行详细描述，通常“细胞株的单克隆性”要求表述为“应确认细胞株来源于单个祖细胞”，由此，比较容易出现细胞株开发人员比较纠结自己采用的细胞株开发路线是否符合要求的顾虑。笔者认为，无论采用何种新技术或者新仪器，都可以参考对标最为传统的有限稀释法（LD）。一般认为，如细胞计数和稀释过程没问题，那么法规部门普遍能接受的方式是两轮有限稀释且铺板浓度不高于0.5 个cell/well。只要实验路线的单克隆概率要优于这种条件下的有限稀释即可。
需要额外注意的是，一些新技术的引入，在提高铺板效率或者单克隆可靠性目的下，可能会引入其他风险，对这些风险笔者认为也需要关注并进行验证。比如高效铺板设备，在提高铺板效率的同时，可能带来交叉污染，识别错误等额外风险，需进行额外验证和管控。
Q：我们单位购置的铺板和成像系统具有很高的单克隆可靠性，有文献或宣传资料声称单克隆可靠性可达99.99%，应该没问题吧？
A：毋庸置疑，高效铺板和成像系统极大地改善了细胞株开发流程，让细胞株开发这个曾经最为费时费力的步骤大为改观。除了上文提到引入额外风险外，应了解：
1.文献或宣传资料的实验是在特定条件或情况下完成的，这种实验条件可能与实际项目开发时的条件差距巨大。因此其参考或者引用价值将大幅降低，简单的如此引用可能会被评审老师批评；
2. 铺板或成像系统可能对细胞存活，或者某些表型特殊的细胞带来难以避免的困难，比如一般铺板系统对易结团细胞处理能力会大幅降低，而易贴壁的细胞会显著影响成像结果的判断；
3.无论采用何种新技术、新路线或者新仪器，在应用到申报项目开发前都应该进行评估并量化相关的关键数据（后续补充验证亦可）。
Q：单克隆性申报数据被评审老师挑战时，应该如何补救？
A：应及时与评审老师进行沟通，尽快确认评审老师关注/挑战的是哪个环节和其希望补充的数据类型，评估项目申报的相关数据并及时进行补充和回复。
就目前小编接触的项目申报遇到挑战的情况，大概有：
1. 申报材料中对细胞株克隆筛选表述不充分，尤其是采用了高效铺板和/或单克隆成像仪的，未能在材料中详细介绍相关原理和采用的实验参数。这种通常只需要补充描述即可；
2. 申报中的实验参数可能较松，有潜在的风险影响单克隆的可靠性，比如有限稀释铺板浓度过高。这种情况处理起来比较麻烦，小编建议进行额外的验证实验，去补充证明其单克隆性，比如FISH；
3. 早些年的细胞株项目，近年才申报，由于实际执行的标准变化或者实验人员的认知变化，导致实验数据不足以支持目前的细胞株单克隆性申报要求。这种情况比较少，处理比第二种情况也复杂一些，如FISH等验证实验外，可能还需要在终产品的品控方面加强，以回应评审的顾虑。
Q：对于一个新建的细胞株开发实验室，该如何考虑细胞株单克隆筛选路线？
A：从最经典的两轮有限稀释到现在大行其道的高效铺板+单克隆成像都是能满足法规需求的。当然，从申报考虑来看，不同的评审/在不同的年代，对同一个方法的要求也是会有一些差异，这跟新方法，新问题不断被发现和解决有关。
1. 有限稀释：2轮浓度不超过0.5细胞每孔（近期有遇到评审要求提供一定数量的孔数概率统计分析来支持单克隆的可靠性）。优点：不需要额外仪器设备支撑，比较节省固定投入；缺点：因为需要2轮，细胞株开发周期较长。铺板效率较低，需要铺较多的细胞板来供筛选。
2. 有限稀释+单克隆成像：一轮不超过0.5。优点：节省一轮有限稀释，由于具有影像支撑细胞株的单克隆性，筛选自主性较强；缺点：需要中等程度的仪器投入。
3. 高效铺板+单克隆成像：一轮铺板+成像。优点：铺板效率大幅提升，铺板量下降，有些带有成像能力的铺板系统，能进一步通过影像辅助单克隆细胞筛选；缺点：仪器投入成本较高。
Q：细胞株开发的方法学验证该如何完成？
A：有限稀释方面，主要是概率统计和计算，这一块小编了解有限，有兴趣的可以找上文提到的一些参考文献来开发相关验证条件和目标。
基于成像仪的单克隆验证，主要涉及两个方面，其一是光学部分，由于通常成像仪都是明场/荧光类型的倒置显微镜架构，涉及的光学部分也主要是如对焦准确性，分辨率，图像拼接等，这部分核心还是在于成像仪功能本身，验证时主要关注影像清晰度，是否能够补偿板底的正常形变等。其二是非光学部分，这块是方法学验证的主体，包括实际细胞入孔的浓度（经验表明，细胞入孔的浓度可能与目标浓度存在很大差异），单个细胞识别的能力，“Ghost Cell”的比率等，验证方式可通过明场（项目开发时采用的成像方式）和荧光进行交叉比对。
对于成像仪的第一部分，选取一套性能可靠的成像仪，验证相对会容易些。总体上来说，目前已经商品化的成像系统，性能存在一些差异，但只要不是太差劲，经验证后，基本上都能满足取代一轮有限稀释的。
如果采用高效铺板体系，则至少需要对铺板体系的效率，交叉污染等进行验证，如依赖于细胞识别的铺板工具，还需对其细胞识别进行验证。对于FACS或微流控体系的铺板系统，其单克隆概率与相关实验参数直接相关，也需要进行相关优化和验证。通常情况下，铺板效率与单克隆性之间会有一个较优参数。
Q: 成像仪提供的影像，在支持细胞株的单克隆来源方面，属于何种类型的数据？“Probability” /“Assurance”/“Evidence”?
A: 这三个英文单词，在中文语境中，都有类似的意思，但在英文表述，尤其在申报材料中，Evidence较少使用，“证据”是可以由正方也可以由反方提出，可以是未经核实或认可的。
法规部门在评审申报材料时，前两者使用频率较高。“Probability”为概率，具体表现在开发流程中，通常指实验人员经验，仪器设备和技术手段等将会影响到最终选用的建库细胞为单细胞来源的可能性。“Assurance”通常是指利用额外的实验去正面或者方面确认细胞株“Clonal”或“Non-Clonal”。
所以，在这个认知范围内，单细胞成像仪（或铺板系统）为仪器/技术手段，应归属于”可提高细胞株单克隆概率”的设备，而非“单克隆影像可以确认细胞株的单细胞来源”。而FISH/NGS等额外验证实验，提供的相关实验结果可归为“Assurance”。
充分认识这一点，对于研发人员提供申报材料或者面对评审老师的挑战时，能更好地理解申报材料中所涉及的相关疑虑点并更有针对性的回复或补充。
Q：经常在细胞株单克隆性上谈到概率的问题，到底什么样的概率是可接受的？
A：从源头上来聊，概率的引入是因为传统有限稀释，由于有限稀释获取单细胞时，既要考虑实验铺板效率的问题，同时也需要考虑单细胞性，因此在高浓度细胞液和低浓度的细胞液之间，一定存在一个合理的浓度，在确保一定有限稀释轮次、一定细胞浓度较为合理的单克隆细胞开发条件。
目前业内讨论这一点，主要引用的文献有两篇：
1. Coller B. & Coller H.在1983年发表关于杂交瘤的有限稀释概率算法；
2. Quiroz J.（2016）和Zhou Y. (2017)发表基于泊松分布分析有限稀释条件下的细胞株单克隆性的概率研究成果，各自有研究的侧重点。
目前，采用泊松分布计算方式的更多一些。在理论值下，按泊松分布计算，细胞株0.5 cell/well的细胞浓度下，一轮有限稀释的单细胞概率为~73%，那么两轮的概率~95%（实际情况如果考虑细胞存活等因素，计算方式要更复杂一些）。
Q：有必要对我实验室内目前的实验流程进行验证么？我都好几个项目申报通过IND了？
A：有，必须有！
从严谨性上来说，新的方法要长期广泛地应用，理应进行相应的验证。这并不仅仅是针对细胞株开发，而是各领域内全方位的，实际上对绝大多数QC或分析部门的实验人员来说，对方法进行验证的必要性是无需讨论的。
近段时间，笔者了解到好几个反馈信息，在IND申报中同方法之前申报无挑战，但新申报遇到了。遇到挑战没必要太担心，因为完全可以后验证，即方法开发应用在前，而后再验证其可靠性。需注意的是，验证条件的设置范围应比实验条件更宽泛。
如有单克隆方法学验证的需要，请联系我们。